Ngày 3 tháng 12 năm 1960, Korolyov bị cơn đau tim đầu tiên. Trong thời kỳ dưỡng bệnh, người ta còn phát hiện ra thận ông bị rối loạn, hậu quả của những năm tháng trong trại cải tạo lao động. Mặc dù các bác sĩ khuyên ông giảm cường độ làm việc, ông trở lại với công việc với mức độ tập trung và khẩn trương hơn trước đó.

Năm 1962, bệnh tim của ông trở nên trầm trọng hơn, ông bị ốm nhiều hơn. Sức khỏe ông giảm sút dần, thính lực suy giảm một phần vì những thử nghiệm động cơ tên lửa. Cuối năm 1965, người ta chẩn đoán ông bị ung thư ruột. Ông qua đời 14 tháng 1 năm 1966 sau 9 ngày trong bệnh viện.

Người dân Xô viết chỉ biết đến đầy đủ tên tuổi và cống hiến của Sergey Korolyov sau ông qua đời. Việc này là để bảo vệ ông khỏi sự chú ý của cơ quan tình báo Hoa Kỳ. Lễ tang của được cử hành long trọng, ông được an táng tại bức tường Kremlin – một vinh dự lớn lao dành cho những cá nhân xuất sắc, nhiều cống hiến của Liên Xô.

Korolev và von Braun là hai người đứng đầu cuộc chạy đua vào khoảng không vũ trụ của Liên Xô và Hoa Kỳ. Khác với von Braun là người đứng đầu không tranh cãi trong lĩnh vực vũ trụ của Hoa Kỳ, Korolev luôn có một đối thủ cạnh tranh trong công việc là Vladimir Chelomei, người cũng được giao triển khai kế hoạch bay lên Mặt Trăng. Những thành tựu vũ trụ ông đạt được dựa trên nền tảng khoa học kỹ thuật Liên Xô mà về nhiều mặt còn thua kém Hoa Kỳ.

Người kế tục Korolev là Vladimir Mishin, một kỹ sư xuất sắc đã làm phó và là cánh tay phải của ông. Chương trình đưa người lên Mặt Trăng của Liên Xô sau đó bị hủy bỏ vì nước Mỹ đã thành công trước Liên Xô.